timi天美传孟若羽

　　重组蛋白的表达

　　1. 将经酶切和测序鉴定正确的重组质粒(pGEX-3X + PER, 表达出融合蛋白GST +PERc134个氨基酸，分子量为26kD + 15kD = 41kD)转入合适的大肠杆菌中。

　　2. 划线接种于LB琼脂+合适的抗菌素(氨苄青霉素，终浓度100μg/ml)的平皿，挑单个菌落，接种于LB+氨苄 2-5ml, 37oC摇过夜。

　　以上已事先准备好。

　　以下为本次实验内容：

　　1. LB 30ml, 加氨苄100mg/ml 30μl, 接种过夜培养的菌液1/50(600μl)，37oC，220转/分摇菌到OD600 = ~ 0.8-1.0 (可目测，在摇菌1.5小时后每半小时观察一次，达到明显混浊为止，约需2-3小时) 。

　　2. 加100mM (24mg/ml) IPTG 1/100体积 (终浓度1mM, 在摇床旁加，以免温度变化太大)，继续摇2小时。

　　3. 将菌液移到50ml管中，2,700转离心15分钟，倒去上清。将菌液转到1.5ml 塑料管中，4 oC，13,000转离心，5’，去净上清。

　　以下均为冰上操作

　　4. 加PBS 1ml, 混匀，取出3μl, 加sample buffer 15μl -20 oC保存 (2x Sample buffer: 0.5M Tris-HCl pH 6.8 0.1ml,10% SDS 0.1ml,甘油0.1ml,β巯基乙醇 10μl，溴酚兰少许)，作为全菌的标本作SDS-PAGE。

　　其余的-70 oC冻融一次。(也可在-70 oC保存，第二天再继续)。

　　5. 加10mg/ml 溶菌酶1/10体积(0.1ml)，冰上放15’。

　　6. 超声粉碎，30”x3 次，强度为液体滚动，但不起沫。

　　7. 加20% Triton X-100 0.05体积 (50μl)，冰上摇30’。

　　8. 4 oC，13,000转离心10’, 上清转到另一管备用。取出15μl, 加sample buffer 7μl -20 oC保存，作为细菌中可溶性蛋白的标本，作SDS-PAGE。

　　亲和层析纯化重组蛋白

　　1. 将Glutathione Sepharose 4B 300μl (约含150μl 凝胶，凝胶能力约500μg蛋白/ml) 放在1.5ml管中，7,000转离心30”, 去上清。加1ml PBS, 混匀，7,000转离心30”, 去上清， 共2次。

　　2. 将上述的细菌裂解上清液加入其中，混匀，室温摇20’。

　　3. 将凝胶和细菌裂解上清液的混合液加柱中，弃去流出液体。用5ml PBS 洗柱2次。

　　4. 堵好下口，加洗脱液 (10mM 还原型谷胱甘肽, 50mM Tris pH 8.0) 500μl，混匀放10’, 收集流出液。反复3次。将3次流出液放一起，即为纯化的重组GST融合蛋白。

　　5. 4C, 5’ 离心，将上清液移至另一1.5ml管中，注意不要把沉淀移出。

　　6. 将纯化的重组蛋白液加到超滤管中，7,000g离心约20’ 至液体100μl左右，加PBS 1ml, 再离心约20’， 至液体剩100-200μl为止，吸出溶于PBS并已浓缩的纯化重组蛋白。取出15μl，加sample buffer 7μl, 作SDS-PAGE。

　　7. 用PBS作为空白，用Nanodrop仪作蛋白定量。

　　厂顿厂-笔础骋贰鉴定重组蛋白

　　将3个标本作SDS-PAGE, 分别观察全菌表达量，是否为可溶性蛋白，重组蛋白纯化的程度

　　1. 配10% SDS-PAGE 的分离胶，双面共需12ml

　　H2O 3.28ml

　　30% Acrylamide+0.8% bis-acrylamide 4ml

　　1M Tris-HCl pH 8.8 4.5ml

　　10% SDS 0.12ml

　　10% APS 0.1 ml

　　TEMED 10μl

　　2. 用水或水饱和正丁醇封好液面。胶凝后倒去液体，用水洗一次，用滤纸吸净液体。

　　灌压缩胶，双面共需4尘濒

　　H2O 2.54ml

　　30% Acrylamide+0.8% bis-acrylamide 0.56ml

　　0.5M Tris-HCl pH 6.8 0.84ml

　　10% SDS 33.4μl

　　10% APS 33.4μl

　　TEMED 3.4μl

　　3. 装在架上后倒入电泳液350ml左右，用电泳液冲洗泳道。

　　(10x 电泳液：Tris 3g, glycine 14.4g, SDS 1g, 水加到100ml)

　　4. 标本用99C加热5’, 上样，共4道，其中一道为蛋白Marker。

　　5. 用120V恒压，至溴酚兰到底部。

　　6. 卸下胶片，固定5’ (固定液：50%异丙醇，10%三氯乙酸)

　　染色约20’ (染色液: 0.1% Coomassie blue R-250, 45% methanol, 10% Acetic acid)

　　脱色约1小时到过夜 (脱色液: 10% Acetic acid)

　　7. 照相