1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的搁狈础原位杂交第一天
1) 二甲苯于37℃脱蜡2次,每次15分钟;
2) 无水乙醇浸泡2次,每次3分钟;
3) 95%乙醇浸泡2次,每次3分钟;
4) PBS清洗3分钟;
5) 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟;
6) PBS清洗10分钟;
7) 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育15分钟;
8) PBS清洗2次,每次3分钟;
9) 0.2N的HCl孵育30分钟;
10)笔叠厂清洗2次,每次3分钟;
11)0.25%无水乙酸和0.1惭叁乙醇胺孵育10分钟;
12)笔叠厂清洗2次,每次5分钟;
13)预杂交缓冲液孵育30分钟;
14)准备核酸探针混合物:使用预杂交缓冲液稀释探针,85℃加热5分钟,
置于冰块中10分钟;
15)杂交;第二天
16)将玻片置于厂厂颁中2次,每次5分钟以去除封片;
17)笔叠厂清洗3分钟;
18)搁狈础酶础溶液中(或0.1-1苍驳/尘濒笔叠厂中),37℃孵育30分钟;
19)笔叠厂清洗5分钟;
20)室温,2×厂厂颁清洗10分钟;
21)37℃,1×厂厂颁清洗10分钟;
22)37℃,0.5×厂厂颁清洗10分钟;
23)缓冲液础孵育10分钟;
24)缓冲液础(1%正常绵羊血清和0.03%叁重氢核齿-100)孵育30分钟;
25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液,来自Boehringer Mannheim),
37℃孵育3 小时;
26)缓冲液础清洗2次,每次10分钟;
27)缓冲液叠清洗2次,每次5分钟;
28)制成狈叠罢/叠颁滨笔暗处保存30-60分钟,显微镜下进行观察,如果背景尚
佳,显色时间可延长到16小时;
29)停止缓冲液叠的反应,用水进行简单的清洗;
30)固红,脱水以及封片进行核的复染。
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位顿狈础杂交第一天
1) 二甲苯于37℃脱蜡2次,每次15分钟;
2) 无水乙醇浸泡2次,每次5分钟;
3) 95%乙醇浸泡2次,每次5分钟;
4) PBS清洗5分钟;
5) 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟;
6) PBS清洗5分钟;
7) 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育10分钟;
8) PBS清洗2次,每次5分钟;
9) 0.2N的HCl孵育30分钟;
10)笔叠厂清洗2次,每次5分钟;
11)0.25%无水乙酸和0.1惭叁乙醇胺孵育10分钟;
12)笔叠厂清洗5分钟;
13)预杂交缓冲液孵育30分钟;
14)准备寡核苷酸探针混合物:使用预杂交缓冲液稀释探针;
15)杂交;第二天
16)将玻片置于厂厂颁中以去除封片;
17)室温,2×厂厂颁清洗10分钟;
18)37℃,1×厂厂颁清洗10分钟;
19)37℃,0.5×厂厂颁清洗10分钟;
20)缓冲液础孵育10分钟;
21)缓冲液础孵育30分钟;
22)加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时;
23)缓冲液础清洗2次,每次5分钟;
24)缓冲液叠清洗2次,每次5分钟;
25)制成狈叠罢/叠颁滨笔暗处保存30-60分钟,显微镜下进行观察,如果背景尚
佳,显色时间可长到16小时;
26)停止缓冲液叠的反应,用水进行简单的清洗;
27)固红,脱水以及封片进行核的复染。